cytoimagINing

El Cell Counter es uno de los plugings que vienen preinstalados en las últimas versiones de imageJ (al menos yo no recuerdo haberlo instalado en mi ordenador): Plugings > Analyze > Cell Counter para inicializarlo.

Es una herramienta bastante sencilla e intuitiva, pero muy útil y definitívamente mas versátil que el "point selección" a la hora de contar células de manera manual ya que permite contar simultaneamente un monton de tipos celulares (GFP+, DAPI, Ki67+andGFP+, etc.). Además, al contrario que la herramienta de "point selección" permite borrar los últimos puntos en caso de equivocarnos y lo mejor es que no es necesario tener la tecla del shift continuamente presionada y los resultados se pueden exportar a una hoja de Excel. ( Results > save as..)

Para sacarle todo el potencial a esta herramienta lo ideal es crear un composite a la hora de combinar las diferentes imágenes de fluorescencia: Image > Color > Merge Channels y seleccionar composite. Lo bueno del combinar los diferentes canales de fluorescencia en un composite es que luego podemos encenderlos o apagarlos a nuestro antojo, de uno en uno o en cualquier combinación posible: Image > Color > Channel Tools.

También, si en lugar de pedir los resultados le pedimos measure... obtendremos las coordenadas y la intensidad de la señal en cada punto.

Otra posibilidad es la de salvar las coordenadas de cada punto para volver a cargarlas en otra imagen lo que nos posibilita hace un tracking de los movimientos de varias celulas con el tiempo.

Autor: Víctor M. Campa.

 Los cultivos célulares y muchas otras muestras biológicas son muy difíciles de ver al microscopio porque son transparentes y debido a ello su contraste es prácticamente nulo. No obstante, existen varias técnicas para aumentar el contraste que son muy utiles a la hora de ver muestras biológicas sin necesidad de realizar ninguna tinción, y que también se pueden combinar con microscopia de fluorescencia. Una de las más conocidas es la técnica de “Differencial Interference Contrast”, también conocida como “Normarski Interference Contrast” que fue desarrollada en los años 50 por Georger Normarski.

En DIC la luz procedente de la lámpara se hace pasar a través de un polarizador colocado a la entrada del condensador. A continuación, todavía antes de que la luz entre en el condensador, el haz de luz polarizada atraviesa un prima “prisma de Wollaston” que divide el haz de luz polarizada en dos haces de luz que vibran a 90º uno respecto del otro (se necesita un prisma diferente para cada objetivo). A continuación el condensador concentra los haces en la muestra, la cual atraviesan paralelos, pero vibrando en direcciones diferentes y por lo tanto incapaces de producir interferencia entre ellos. Al atravesar la muestra, la trayectoria de los rayos es alterada dependiendo del grosor y del índice refractivo de la muestra. Luego son enfocados por el objetivo sobre un segundo prisma que los vuelve a combinar juntos, pero las trayectorias de estos han sido alteradas al atravesar el objetivo. Por último un segundo polarizador colocado a 90º del primero elimina aquellos rayos cuyas trayectorias no han sido modificadas y dejar pasar solo los que han sido alterados por la muestra, creando una imagen en 3D que es refleja las propiedades refractivas de esta. Cambios en la orientación del espécimen pueden modificar drásticamente su apariencia tridimensional; 180º cambian un valle por una cima).

Por lo tanto para realizar DIC o NIC se necesita que el microscopio disponga de dos polarizadores (uno denominado analizador) y dos prismas especiales denominados Normarski o Wollaston, además de los componentes ópticos normales de un microscopio.

Ajuste del microscopio para DIC.

1)      Lo primero es comprobar que los elementos requeridos están presentes. Se requiere (no estoy seguro de si es indispensable o solo se recomienda) un objetivo especial para DIC el cual se tiene que usar con su correspondiente prisma del condensador. Respecto al prisma del objetivo, a veces es suficiente uno para todos los objetivos y en otras ocasiones se requiere también uno específico para cada objetivo; depende del fabricante del microscopio. En el Leica con el que tome esta imagen es del último tipo.

2)      A continuación ajustar el microscopio para iluminación Köhler sin que los prismas ni los polarizadores estén colocados en el paso de luz. El revolver del condensador debe de estar en la posición de campo claro (0, B o BF).

3)      Insertar en Polarizador y el Analizador. Sus acimuts de transmisión deben de ser perpendiculares. Normalmente estos vienen predeterminado porque solo se puede colocar en una determinada posición y no rotan.

4)      Observar el plano focal trasero del objetivo insertando la lente de Bertrand o simplemente quitando uno de los oculares. Si ambos están correctamente alineados aparécera una cruz negra con los brazos orientados en vertical y horizontal que llena la practica totalidad del campo visual. Sino habría que alinearlos para producir la máxima extinción.

5)      Insertar el prisma del objetivo. Ahora debería de aparecer una línea negra bien definida que pasa por el centro del campo visual con una inclinación de 45º. Si es necesario alinear la línea hasta que ocupe una posición central. El prisma del objetivo normalmente se puede mover con una rosca.

6)      Sacar el prisma del objetivo e insertar el prisma del condensador adecuado para el objetivo que estamos utilizando. De nuevo al enfocar con la lente de Bertrand se debería observar una línea como la misma orientación que la anterior. Ambas líneas deberían de ser lo mas identicas posible. Este prisma suele estar fijo y para moverlo se requiere ajustar con un destornillador los tornillos que lo fijan al revolver del condensador.

7)      Retirar la lente de Bertrand, reinsertar el prisma del objetivo, y enfocar el espécimen. La imagen debería de aparecer muy oscura ya que estamos observando la muestra con una extinción máxima. Normalmente hay que abrir subir al máximo, o casi, la potencia de la lámpara. Por ultimo, mientras observamos la muestra hay que trasladar perpendicularmente al paso de luz el prisma del objetivo (debería haber una rosca o un control para ello) para producir un bias en el paso de los dos haces de luz y crear con ello el deseado efecto tridimensional.

Se puede combinar DIC con otras técnicas como microscopía de fluorescencia,  pero el analizador disminuye drásticamente la intensidad de la fluorescencia por lo que es necesario quitarlo antes de realizar la imagen de fluorescencia.

Ojo al rotar los filtros y volver a iluminación en campo claro normal, ya que si estamos mirando directamente por el ocular mientras cambiamos los filtros o retiramos el polarizador la intensidad de la luz con la lámpara el máximo es cegadora.

Autor: Víctor M. Campa

1. Focus on the specimen. This step is most important. You might select an area of low contrast to make things easier.
2. Decrease the size of the diaphragm located nearest the light source (field diaphragm) so that you can see its edges.
3. Bring the edges of the field iris into focus by raising or lowering the condenser focusing knob. Both the specimen and the iris should be in focus.
4. Center the image of the field iris using the condenser-centering knobs (usually facing you on the condenser)
5. Open the centered and focused field diaphragm so the edges lie just beyond the field of view.
6. Adjust the condenser diaphram to increase or decrease image contrast. The optimum opening depends on the specimen. Never use this aperture to control light intensity.
7. Adjust light intensity with the light power supply or with neutral density filters (for color photography).

In a correctly adjusted Köhler illuminated microscope specimen contrast is obtained by adjusting the condenser diaphragm. Illumination intensity is varied by adjusting the voltage to the light source or by placing neutral density filters in front of the illuminator.

Es importante tener en cuenta que la resolución lateral además de depender de la apertura numerica del objetivo también depende de la apertura del "condender diaphram". Mayor resolución cuanto mayor apertura (aunque también menor contraste). Se recomienda una apertura de este diafragma entre el 90 y 60% de la apertura del objetivo para sacar el máximo rendimiento al objetivo. Para ajustar esta apertura hay que remover uno de los eyepieces y mirar directemente al plano focal posterior del objetico mientras se cierra la apertura del condenser diaphram hasta que el circulo de luz quede reducido hasta un 90 a 60% del máximo.

Víctor M.

Left: No primary antibodies X ni Y. Only secondary antibodies X and Y + Non-binding antibody + F(ab) fragments.

Medium: No primary antibody Y. Primary antibody X + secondary antibodies X and Y + Non-binding antibody + F(ab) fragments.

Right: Double IF with two primary mouse antibodies. See below.

Tienes un par de anticuerpos que van muy bien para inmunofluorescencia y te estas planteando hacer una tinción con ambos a la vez para ver su colocalización, pero hay un pequeño problema; ambos son de la misma especie. ¿Qué hacer entonces? Pues se puede teñir primero con uno de los anticuerpos, luego bloquear este con fragmentos Fab sin marcar y a continuación hacer una segunda tinción con el otro. Si combinamos este protocolo con DAPI, un anticuerpo primario de otra especie y un secondario en el infrarojo con un poco de cuidado podemos realizar una tinción en cuatro colores.

 Referencia: Stephanie A. Lewis Carl et al. (1993) The Journal of Histochemistry and Cytometry. Vol. 41, pp. 1273-1278.

Protocolo:

Fix with fresh 4% PFA for 10-15 minutes.

Wash 3 times with PBS for 5 minutes.

Block with Glycine 100mM pH 8.5 for 10-20 minutes (it is possible to add 1% goat serum).

Permeabilize with 0.1% Triton X-100 in PBS for 10 minutes.

Incubate 1 hour at RT with primary mouse antibody X.

Wash 3 times with PBS for 5-10 minutes.

Incubate 1 hour with secondary antibody X (goat anti-mouse Alexa488) 1:400 in PBS.

Wash 3 times with PBS for 5-10 minutes.

Incubate 1 hour with a non-binding mouse antibody as mouse anti-GFP used at the aprox. same concentration (not dilution) as mouse antibody X in PBS.

Wash 3 times with PBS for 5-10 minutes.

Incubate 1 hour with goat anti-mouse IgG F(ab) fragments (50 mg/mL) in PBS.

Wash 3 times with PBS for 5-10 minutes.

Incubate 1 hour at RT with primary mouse antibody Y.

Wash 3 times with PBS for 5-10 minutes.

Incubate 1 hour with secondary antibody Y (goat anti-mouse Alexa594) 1:400 in PBS.

Wash 3 times with PBS for 5-10 minutes.

Stain with DAPI and mount.

Autor: Víctor M. Campa

Antes de hacer una inmunostaining es conveniente comprober que los fluoroforos que vamos a utilizar son los mas adecuados para la combinación de filtros y laseres que tenemos disponibles en el microscopio. Para facilitar esta tarea al sus clientes, distintas casas comerciales tienen distintos programos on-line (normalmente en JAVA) que nos permiten jugar con distintas combinaciones de filtros y laseres.

A mi el que mas me gusta es el de BD Biosciences ya que nos calcula la cantidad de fluorecencia que se nos escapa a un canal que no es el suyo (el temido blead through):

http://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/index.jsp

Otro que tambien esta muy bien y que es muy sencillo de utilizar es el de Molecular Probes:

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html

Por ejemplo si excitamos una muestra tenida con DAPI, FITC y Cy3 con el laser de Ar/Kr a 488nm el DAPI no se excitaria en absoluto, el FITC se excitaria al 88% de su capacidad y el Cy3 lamentablemente se excitaria al 29% de su capacidad. Por ello a la hora de recoger la fluorescencia emitida por el FITC hay que escoger el filtro de emision con un poco de cuidado. En este caso, con un filtro 520/40 recogeriamos un 61,5% de la fluorescencia emitida por el FITC y un 2,7% de la emitida por el Cy3. Con este filtro tambien recojeriamos un 50% de la emtida por el DAPI, pero como este no es excita con el laser de 488 no hay ningun problema.

Al final recojeríamos alrededor de un 53% (0,88x0,53) de la fluorescencia que puede emitir el FITC y solo un 0,78% (0,29x0,027) de la que puede emitir el Cy3. O sea, que si la intesidad de la tinción fuese similar la señal proveniente del FITC sería unas 68 veces mayor que la del Cy3. O sea que un 1.5% de la señal adquirida al fotografiar el FICT provendria del Cy3, lo que no esta demasiado mal. No obstante hay que tener cuidado porque si la intensidad de la tinción del Cy3 es 10 veces mayor que la del FITC, la cantidad de señal que se nos colaria también seria 10 veces mayor y llegaría al 15%.

Autor:

Víctor M. Campa 

A veces no nos queda más remedio que contar células a mano. Hay una herramienta muy útil para hacer este trabajo un poco menos pesado. Es la de selección puntual (al lado de la varita mágica). Luego se selecciona cada célula que queramos contar individualmente manteniendo presionado el boton de shift e ImageJ llevara la cuenta por nosotros.

Mucho ojo con levantar el dede del shift porque el programa volvera a comenzar desde el principio.

Autor: Víctor M. Campa

Tomado de la página web de imageJ:

Point Selection Tool
Use this tool to create a point selection, to count objects or to record coordinates. Click once to create a single point selection. Shift-click to add more points. Click on a point and drag to move it. Alt-click on a point to delete it. Alt-click and drag with the rectangular or oval selection tool to delete multiple points. Double-click on the point tool icon to display the following configuration dialog box.

If Auto-Measure is checked, clicking on an object in the image records its location and intensity and, if Mark Width is greater than zero, draws a mark in the current foreground color. The marks modify the image so it may be wise to work with a copy. Set the mark width to zero to disable marking. Note that color marks are only available with color images or grayscale images that have been converted to RGB. If Auto-Next Slice is checked, ImageJ will advance to the next stack slice after each measurement is recorded.

Use the Edit>Draw command to permanently draw a circular marker on the image at the location of each point. The makers are drawn in the current foreground color using a diameter of Mark Width.

Imagen confocal de un grupo de celulas. Membrana plasmatica en verde, citoplasma en rojo, núcleo en azul.

Quizas menos espectacular que el 3D viewer, pero más útil es el RGB Profiler. Este es un pluging que nos da la intensidad de cada canal (Rojo, Verde y Azul) a lo largo de una linea recta que dibujamos en la imagen.

Para incorporar el RGB Profiler en ImageJ unicamente hay que copiar el archivo RGB Profiler.class, que podemos encontrar a traves de la pagina de pluggings de ImageJ, directamente en la carpeta de pluggings de ImageJ. Al abrir de nuevo el programa, encontraremos el RGB profiler incorporado entre sus pluggings.

Para utilizarlo hay que trazar un linea recta sobre la imagen a analizar y luego simplemete: Pluggings > RGB Profiler. Ya tenemos el perfil a lo largo de la linea. En esta caso en verde he realizado una inmuno contra una proteina de membrana, en rojo contra una citosolica y en azul he tenido el nucleo con DAPI. La imagen la adquiri con el microscopio confocal para evitar fluorescencia inespecifica proveniente de planos distintos al de enfoque y este plano corresponde mas o menos al medio de la célula.

Perfil de lcada uno de los canales de la imagen anterior a lo largo de la línea indicada

Es interesante hacer aumentar un poco el grosor de la línea para reducir el ruido: Edit > Options > Line Width (en este caso tiene 10 pixeles de grosor) e incorporarla en la imagen para indicar exactamente por donde hemos trazado el perfil: Edit > Fill (también Edit > Draw). Se puede escojer el color de la línea: Edit > Options > Colors...

Autor: Victor M.

Ahora que ya podemos abrir los archivos del confocal (ver post anterior) podemos empezar a manipularlos en el imageJ. Por ejemplo podemos realizar una reconstrucción tridimensional a partir de las imagenes obtenidas con el confocal a hacer una "Z serie".

Una de las imagenes de la serie Z del canal del DAPI que utilize para la reconstrucción.

Para ello lo primero que hay que hacer es instalar el plugging "3D Viewer". Para ello solo hay que copiar el archivo "ImageJ_3D_Viewer.jar" dentro de la carpeta de pluggings de ImageJ y reiniciar el programa. Este Plugging necesita que tenemos tengamos instalado en el ordenador Java3D. Si lo tenemos instalado perfecto sino hay que bajar el plugging "Install_Java3D" a al imageJ para que este lo instale por nosotros y además también debemos de bajar los archivos de instalación ZIP de Java3D. Tanto el proceso de instalación de Java3D como del plugging 3D Viewer vienen perfectamente exlpicados en la pagina web del "Virtual Insect Brain Lab" en el apartado download > ImageJ.

Una vez que hemos instalado Java3D en nuestro ordenador y el plugging 3D Viewer en ImageJ lo primero que hay que hacer es abrir el Z stack que hemos adquirido con el microscopio confocal. Para ello utilizamos el plugging LOCI descrito en el post anterior.

Pluggings > LOCI > Bio-Fotmats Importer.

Seleccionar el archivo .lei en el que el sotfware LCS guarda se encuentra las imagenes adquiridas con el microscopio confocal. Seleccionar: View Stack with- Standard ImageJ, Satck Order- Normal, split channel y autoscale. Si tenemos varias series (hemos guardado varios escaneos diferentes dentro de un solo experimento) hay que escojer cual es la serie (Z-Stack) que queremos abrir.

OK. Se deberian de una stack diferente por cada canal que hayamos adquirido. Ahora hay que convertir esas stacks a 8 bits.

Image > Type > 8 bits

 Ahora ya podemos empezar a hacer la reconstruccion en 3D.

Plugging > Image 3D Viewer.

Se abrira un submenu "Add" que nos pide lo que queremos hacer.

Image- Seleccionar la stack con el canal que queremos reconstruir (hay que introduccirlos de uno en uno, por eso pedimos antes abrir los canales por separado y no combinado)

Name- Nombre

Display- As Surface

Color- Escojer un color

Threshold- Es un número entre 1 y 256. Hay que introducir el umbral por encima del cual consideremos la señal como positiva. Se puede jugar con el nivel "minimum" en Image > Adjust > Brightness/Contrast para hacernos una idea de cual es el valor ideal para nuestra stack. Eso si utilizando uno de las imagenes de por el medio de la stack o con elevada señal. De todas formas este valor se puede volver a ajustar facilmente mas adelante.

Resampling factor- 4 o mas para una patata de ordenador, 3 para un ordenador decente, 2 o 1 para un superordenador,.

Ya tenemos una recontruccion en 3Ds de ese canal que podemos rotar a nuestro antojo con el raton. Ahora hay que ir añadiendo el resto. En el menu de la propia ventana del ImageJ 3D Viewer:

File > Add Content y repetir el proceso, pero selecionando otro canal diferente.

Una vez que hemos cargado todos los canales es posible cambiar su color, el threshold, o la tranparencia de cada canal. Para ello solo hay que seleccionar el canal en cuestion en "Select" e ir a "Edit > Atributes".

Por ultimo se puede grabar un video .AVI de nuestra recontruccion.

View > Record 360º deg rotation o "Start Freenand Recording" and Stop Freehand Recording"

Autor: Victor M.

Este es un ejemplo del tipo de post que me quiero ir subiendo a este blog. Pequeños trucos que te facilitan la vida, pero que no son nada obvios y que te hacen perder un montón de tiempo. Así si en el futuro tengo que utilizar imageJ en otro ordenador (o alguién que lea el blog se encuentra con este problema) pues aquí está la información necesaria para resolverlo.

En nuestra unidad de microscopía tenemos un microscopio confocal Leica DH IRE2 que es una maravilla: 5 lasers para la excitación, posibilidad de escoger el espectro de emisión que queramos, alta velocidad de escaneo, gran sensibilidad y además lo mejor es que es “user friendly”. Después de adquirir las imágenes, el software de Leica las salva todas las imágenes de lo que el llama un experimento juntas en una carpeta bien como RAW o como TIFF. Esta carpeta lleva asociado un archivo .txt con información sobre los parámetros de adquisición y un archivo .lei que permite abrirlas por el programa del confocal LCS.

Estas imágenes las podemos abrir en nuestro ordenador con la versión gratuita de LCS distribuida por Leica (gracias a Bruno por la información). Este programa se puede bajar desde la siguiente pagina web: http://www.sanraffaele.org/58226.html?page=9#fs4. No obstante sus prestaciones son bastante limitadas.

ImageJ no reconoce los archivos .lei, pero es posible abrir los archivos TIFF de manera individual en el imageJ y luego conbinarlos en una stack una vez abiertos.

Image > Stacks > Images to Stack

Hay que abrir las imágenes de cada canal por separado y en el orden en el que se adquirieron ya que el programa coloca todas las imágenes abiertas en una sola stack y las ordena según el orden de apertura.

Esto es suficiente si el número de imágenes que hemos adquirido no es demasiado elevado, pero cuando tenemos muchas imágenes se hace muy pesado. Además perdemos la información relativa a los parámetros de adquisición como por ejemplo la distancia o tiempo que separa cada imagen. Por esto para abrir las imágenes cargadas con el confocal lo mejor es instalar un plugling que permite al ImageJ reconocer varias tipos de archivos no convencionales. El plugling en cuestion se llama “LOCI Bio-Formats library” y se puede encontrar un enlace para bajarlo en la sección de pluggings de la pagina web del propio ImageJ. Este plugling no solo permite abrir archivos .lei sino una multitud de formatos como por ejemplo los archivos .zvi del programa Zeiss AxioVision (aunque aún no lo he probado, cuando lo haga actualizare el post). Para instalar el plugging solo hay que bajar el archivo “loci_tools.jar” (yo me baje la version 4.0.1 stable release) y copiarlo en la carpeta pluglings que esta dentro de la carpeta del propio ImageJ. Al reiniciar ImageJ el plugling sera reconocido por el programa. En algunos casos (a mi me paso) el archivo se guardo con extensión ZIP y el programa no lo reconoce. En este caso solo hay que cambiar a mano la extension y volver a poner .jar y problema solucionado. Pero bueno todo esto esta muy bién explicado en la pagina desde donde se baja el plugging.

Una vez instalado para abrir los archivos en cuestion. En este caso .lei:

Plugins > LOCI > Bio Formats Importer > Escoger el archivo .lei que queremos abrir > OK.

Y por arte de magina se abren los archivos LCS